2017 год, №4

Содержание выпуска
ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК В КАЧЕСТВЕ ЖИДКОСТНОЙ БИОПСИИ
Филипенко М. Л.
Стр. 5 — 13
Внеклеточная ДНК (вкДНК) была обнаружена в плазме крови человека в середине прошлого века, однако ее диагностический потенциал стали по-настоящему активно изучать лишь в последние несколько десятилетий в связи с накоплением данных о геноме и эпигеноме клетки человека в норме и при различных патологиях и бурным развитием методов анализа ДНК и ее модификаций. Использование вкДНК для диагностики заболеваний принято называть жидкостной биопсией. В настоящем обзоре рассматриваются история открытия вкДНК, современные представления об источниках вкДНК в организме и перспективные направления применения анализа вкДНК в медицине. В частности, чаще всего жидкостную биопсию используют в онкологии, но метод актуален и для таких направлений, как пренатальная диагностика, прогноз отторжения имплантатов органов и прогноз сепсиса.
АНАЛИЗ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ RAS-КАСКАДА СВОБОДНО ЦИРКУЛИРУЩЕЙ ДНК ПЛАЗМЫ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ С КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ МЕТОДОМ УСИЛЕННОЙ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПЦР В «РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ»
Телышева Е. Н., Снигирева Г. П.
Стр. 14 — 20
Анализ внеклеточной ДНК (жидкостная биопсия) - перспективное направление в современной медицине, особенно в онкологии. В статье представлены результаты исследования соматических онкоспецифических мутаций в свободно циркулирующей ДНК (сцДНК) плазмы крови пациентов с колоректальным раком стадий I-IV методом усиленной аллель-специфической полимеразной цепной реакции в «реальном времени». Названный метод был разработан специально для анализа биологических образцов, содержащих небольшое количество мутантной опухолевой ДНК. В исследование включили 46 человек (18 женщин, 28 мужчин) в возрасте 48-86 лет (средний возраст - 67,1 ± 8,8 года). Все пациенты получили хирургическое лечение (радикальное - в 85 % случаев). Молекулярно-генетическое исследование сцДНК плазмы крови проводили на основе результатов стандартного исследования образцов опухолевой ткани. Кровь отбирали до операции и на 5 день после нее. Анализировали мутации в генах KRAS и BRAF, которые были выявлены в ткани опухоли. Результаты исследования показали, что изучаемый метод позволяет выявлять мутации в генах RAS-каскада чаще на стадиях II-IV заболевания, а порог его чувствительности составляет 0,1 %. Исследование сцДНК до и после операции предположительно может давать дополнительную информацию о качестве хирургического вмешательства, появлении метастазов или существовании недиагностированных метастазов. Метод усиленной аллель-специфической ПЦР в «реальном времени» должен быть валидирован и оценен в различных клинических ситуациях.
МОДИФИКАЦИЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР В «РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ» ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ФРАКЦИЙ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК РАЗНОГО РАЗМЕРА
Соколова Е. А., Хлистун И. В., Кушлинский Д. Н.
Стр. 21 — 25
Данные о распределении фрагментов внеклеточной ДНК (вкДНК) по фракциям в зависимости от их размера могут иметь диагностическую ценность. В статье описывается разработанный и валидированный авторами метод мультиплексной количественной полимеразной цепной реакции в «реальном времени» для исследования степени фрагментированности вкДНК плазмы крови. Метод основан на определении фрагментов Alu и hLINE-1 с помощью флуоресцентных зондов. Были подобраны последовательности праймеров и зондов, проведена оптимизация ПЦР и оценка динамического диапазона измерений и нижнего порога детекции. Аналитические характеристики метода: динамический диапазон измерений - 6 порядков, эффективность ПЦР - более 90 %. С использованием разработанного подхода было показано, что индекс фрагментированности вкДНК плазмы крови женщин с раком яичников стадий III-IV (n = 14) не отличается достоверно (p = 0,34) от этого показателя у здоровых женщин (n = 16). В дальнейшем следует проводить исследование на более крупной выборке, а также использовать электрофоретическую селекцию фрагментов вкДНК по фракциям.
ОЦЕНКА ПРЕДСТАВЛЕННОСТИ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ РНК ИЗОФОРМ VEGF В ПЛАЗМЕ КРОВИ ПАЦИЕНТОК С РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Тыщик Е. А., Кометова В. В., Родионов В. В., Ребриков Д. В.
Стр. 26 — 30
Проанализирован уровень представленности внеклеточных РНК IL-6, IL-8, IL-18 и трех сплайсинговых вариантов фактора роста эндотелия сосудов VEGF: 121, 165 и 189 - в плазме крови пациенток с раком молочной железы I и II стадий в сравнении с контрольной группой обследуемых без онкологических заболеваний. Для IL-8 и IL-18 подтвержден, а для изоформ VEGF-121 и VEGF-165 впервые продемонстрирован значимо повышенный уровень внеклеточных РНК в группе пациенток с раком молочной железы на ранних стадиях.
ОЦЕНКА ЗНАЧИМОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА MIR-146A В ПЛАЗМЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА
Ширшова А. Н., Шамовская Д. А., Боярских У. А., Апалько С. В., Лесков Л. С., Соколов А. В., Коваленко С. А., Щербак С. Г., Пикалов И. В., Кель А. Э., Филипенко М. Л.
Стр. 31 — 36
Колоректальный рак (КРР) - один из наиболее распространенных видов рака в мире. Эффективные методы скрининга для своевременного выявления КРР и аденоматозных полипов могут значительно снизить смертность от этого заболевания. МикроРНК - новый класс потенциальных биомаркеров для широкого круга заболеваний человека, включая онкопатологии. В статье оценивается диагностическая значимость концентрации микроРНК miR-146a в плазме крови человека с КРР. В опытную группу включили пациентов с колоректальным раком стадий I-III (n = 102), а в контрольную - пациентов с хроническим колитом, неспецифическим язвенным колитом и болезнью Крона (n = 58) и условно здоровых людей (n = 42). Количество микроРНК определяли при помощи ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с детекцией результатов в «реальном времени». Было показано, что концентрация miR-146a статистически значимо выше в образцах плазмы крови пациентов с КРР в сравнении с пациентами контрольной группы (p < 0,0001). Оптимальное значение диагностической чувствительности, определенное с помощью ROC-анализа, составило 47,3 %, специфичности - 91,5 %, AUC = 0,79 ± 0,018. Исследуемый подход обладает недостаточно высокой специфичностью, но показано, что miR-146a в будущем может быть включена в состав диагностических профилей на основе нескольких микроРНК с улучшенной специфичностью.
СЕМЕЙНЫЙ СЛУЧАЙ СИНДРОМА КОЭНА: КЛИНИЧЕСКОЕ НАБЛЮДЕНИЕ
Левченко О. А., Зинченко Р. А., Лавров А. В.
Стр. 37 — 41
Синдром Коэна - редкое аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующееся умственной отсталостью, мио- пией, гипотонией, ожирением и деформацией костей. Заболевание имеет выраженный меж- и внутрисемейный клинический полиморфизм, что затрудняет его клиническую диагностику. Ген VPS13B, мутации в котором приводят к развитию синдрома, имеет 62 экзона, и полный его анализ в практике не применяется. Нами описан семейный случай синдрома Коэна. Брат и сестра из метисированного абазино-черкесского брака имеют диагноз «умственная отсталость в стадии имбецильности». У обоих пробандов с рождения отмечена задержка психомоторного развития. В школе учиться не смогли, писать, читать, считать не научились. Несмотря на некоторые общие неспецифические признаки, различия в фенотипе не позволили установить диагноз, и был назначен полноэкзомный анализ. Найдена однонуклеотидная замена с.7603C>T, приводящая к образованию преждевременного стоп-кодона R2535* в гене VPS13B. Носителями мутации оказались мать, больные сибсы и один из двух здоровых сибсов. Вторую мутацию найти не удалось. По итогам детального анализа фенотипа и с учетом выявленной мутации установлен синдрома Коэна у обоих пациентов.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧАСТОТЫ ВСТРЕЧАЕМОСТИ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ КОМБИНАЦИИ ТЕХНОЛОГИЙ ПЦР «В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ» И ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ У БОЛЬНЫХ ФЕНИЛКЕТОНУРИЕЙ МОСКОВСКОГО РЕГИОНА
Никифорова А. И., Абрамов Д. Д., Кадочникова В. В., Зобкова Г. Ю., Огурцова К. А., Брюханова Н. О., Шестопалова Е. А., Кочеткова Т. О., Шубина Е. С., Донников А. Е., Трофимов Д. Ю.
Стр. 42 — 49
Определена частота встречаемости мутаций в гене фенилаланингидроксилазы () у неродственных детей (n = 71) с диагнозом «фенилкетонурия», наблюдавшихся в Морозовской детской городской клинической больнице (г. Москва) в 2015-2016 гг. Для выявления частых вариантов мутаций в гене была применена оригинальная технология определения нуклеотидных замен на основе ПЦР в режиме «реального времени» (real-time PCR), выполнено дополнительное исследование гена методом целевого секвенирования нового поколения (NGS). Эффективность диагностирования методом ПЦР при выявлении носительства патогенного аллеля в выборке составила 83 %. При проведении комбинированной диагностики мутации в двух аллелях были выявлены в 66 случаях из 71. Всего определено 26 патогенных мутаций в гене , наиболее часто представлены мутации p.R408W (47,9 %) и p.R261Q (9,9 %). Распространенные в России IVS10nt546, IVS12+1G>A, p.R158Q, p.Y414C, IVS4+5G>T выявлены с частотами от 4,2 до 2,8 %. Суммарная частота встречаемости половины определенных вариантов мутаций составила менее 10 %. По итогам секвенирования гена обнаружен ряд ранее не описанных для Московского региона мутаций различного функционального типа: p.D222Terfs, p.R111Ter, p.F161S, p.G188D, p.R270K, p.L311P, p.F55L, p.F55Leufs, IVS1+5G>T, IVS8-7A>G. Мутации p.D222Terfs и p.R111Ter (с частотами 2,1 % каждая) являются потенциальными кандидатами на включение в состав скрининговой панели. Полученные данные могут быть использованы для разработки схем генодиагностики фенилкетонурии.
АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ И С ПАРАМЕТРАМИ ВАРИАБЕЛЬНОСТИ СЕРДЕЧНОГО РИТМА У СПОРТСМЕНОВ РЕСПУБЛИКИ КАРЕЛИИ
Коломейчук С. Н., Алексеев Р. В., Путилов А. А., Мейгал А. Ю.
Стр. 50 — 58
Целью настоящего исследования было изучение распределения частоты аллелей гена ангиотензинпревращающего фермента и рецептора β2 брадикинина у спортсменов различной спортивной специализации, а также выявление взаимосвязи генотипа с параметрами вариабельности сердечного ритма. Методом ПЦР в группе атлетов (n = 75, мужчины) исследован полиморфизм генов I/D и +9/-9. Показано достоверное отличие между группами спортсменов по частоте генотипа -9/-9 гена BDKRB2. Уровень парасимпатической активности преобладает у носителей аллеля I гена . В группе спортсменов с генотипом D/D регистрируются низкие значения временных параметров вариабельности сердечного ритма. Согласно полученным данным, временные параметры ритма сердца спортсменов с генотипом I/I отличаются от значений групп I/D и D/D. У гомозигот по аллелю -9 гена отмечены самые низкие значения ЧСС, что указывает на усиление парасимпатических влияний в системе регуляции сердечного ритма. Аллель -9 гена ассоциирован с минимальной продолжительностью последовательных сокращений сердца. Полиморфные локусы ACE I/D и +9/-9 можно рассматривать как контрольные показатели процесса регуляции параметров сердечной деятельности при проведении первичного отбора спортсменов в Республике Карелии.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ НЕТИПИЧНОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО ВИДА , ВЫЗВАВШЕГО АБСЦЕСС ГОЛОВНОГО МОЗГА, СЕКВЕНИРОВАНИЕМ ПО СЭНГЕРУ ГЕНА 16S РРНК ИЗ ДНК ОБРАЗЦА ГНОЯ
Гордукова М. А., Дивилина Ю. В., Мишукова О. В., Галеева Е. В., Продеус А. П., Филипенко М. Л.
Стр. 59 — 62
Представлено описание клинического случая: наблюдали девочку в возрасте 14 лет 11 мес с абсцессом головного мозга, для которого не удалось установить возбудителя стандартными микробиологическими методами. До и в течение периода госпитализации у ребенка отсутствовала лихорадка, а многие антибиотики вызывали аллергические реакции, в связи с чем диагностика и терапия инфекции были затруднены. Пациентке были выполнены три операции. Четырежды производили посев гноя из абсцесса, но ни разу не наблюдали роста культуры. Дважды проводили ПЦР-анализ, но в обоих случаях результаты исследования были отрицательными. Тогда был амплифицирован и секвенирован по Сэнгеру ген 16S рРНК из образца ДНК, экстрагированной из гноя. С помощью программы BLAST была показана высокая гомология (99 %) определенной последовательности с последовательностью гена 16S рРНК бактерии (штамм ChDC B589, KF733728.1), для которой ранее была описана роль в развитии абсцессов головного мозга. Терапия против этого микроорганизма, начатая еще до получения результатов секвенирования, привела к положительной динамике и купированию процесса у ребенка. Таким образом, в отдельных случаях секвенирование может являться практически единственным способом идентификации потенциального возбудителя.
ВОЗМОЖНОСТЬ ПРОВЕДЕНИЯ ФОТОН-ЗАХВАТНОЙ ТЕРАПИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ 6 МВ ФОТОННОГО ИЗЛУЧЕНИЯ
Воробьева Е. С., Липенгольц А. А., Черепанов А. А., Григорьева Е. Ю., Нечкина И. Н., Калыгина Н. С., Соковиков А. В., Кулаков В. Н., Шейно И. Н.
Стр. 63 — 67
Фотон-захватная терапия (ФЗТ) - метод лучевой терапии, который обеспечивает повышение поглощенной дозы в опухоли без дополнительной лучевой нагрузки на окружающие нормальные ткани. В работе представлены результаты экспериментального исследования возможности увеличения поглощенной дозы при ФЗТ за счет использования 6 МВ фотонного излучения. При помощи водных растворов ферросульфатных дозиметров было проведено прямое измерение величины поглощенной дозы в воде, содержащей йод (дозоповышающий агент) в концентрации от 2,5 до 50 мг/мл. Облучение растворов проводили на линейном медицинском терапевтическом ускорителе СЛ75-5-МТ (Россия) в дозе 5 Гр без учета возможного увеличения поглощенной дозы за счет присутствия атомов йода. Для концент- раций йода 2,5-20 мг/мл достоверного увеличения поглощенной дозы зарегистрировано не было. Для концентрации йода 50 мг/мл увеличение поглощенной дозы составило 13 ± 5 % (p < 0,05). Поскольку типичные концентрации дозоповышающих агентов при введении в организм пациентов, как правило, находятся в диапазоне 2,5-15 мг/мл, использование 6 МВ фотонного излучения для достижения терапевтически значимого противоопухолевого эффекта не представляется целесообразным.